Jednotlivé enzymové systémy
V této části jsou uvedeny detaily o jednotlivých enzymových systémech a návody na barvení. Uvádíme vždy (pokud jsou informace v literatuře dostupné):
- zkratku enzymu a název (v angličtině, české názvy jsou stejné, jen s českými koncovkami)
- oddělené pomlčkami: E.C. číslo, kvarterní strukturu, lokalizaci v buňce (c – cytosol, m – mitochondrie, p – plastidy) a počet lokusů
- praktické poznámky, upozornění na možné komplikace, apod.
- složení barvicích roztoků (názvy chemikálií z praktických důvodů anglicky); návody na pufry viz Roztoky a pufry
- informace k barvení (teploty, odchylky od standardního postupu, apod.)
ACP – acid phosphatase
E.C. 3.1.3.2 – monomer, dimer – c, m, p – 2 až 4
| 0,05M sodium acetate buffer, pH = 5.0 | 30 ml (+ asi 50 ml na oplachování) |
|---|---|
| 1-naphthylphosphate 50 mg | |
| Fast Black K salt 5 mg |
Po skončení elektroforézy neoplachujeme kvůli pH v destilované vodě, ale v předem vychlazeném pufru (je proto třeba proto připravit asi 100 ml pufru). Barvení při 37°C ve tmě
ADH – alcohol dehydrogenase
E.C. 1.1.1.1 – dimer – c – 1 až 3
často variabilní; dosti citlivý na teplotu; někdy se na gelu negativně barví také SOD
| Roztok A: | |
|---|---|
| 0,1M Tris–HCl buffer, pH = 7.5 | 40 ml |
| NAD+ 15 mg | |
| MTT 10 mg | |
| PMS 1 mg | |
| Roztok B: | |
| ethanol (chlazený v lednici) 10 ml | |
Přidat ke gelu roztok A, inkubovat ve tmě při 32°C, po 2-3 minutách přidat ethanol (roztok B). V případě, že se gel barví slabě, přidávat další dávky ethanolu vždy po 1 hodině; možné je i prodloužit úvodní inkubaci bez ethanolu až na 10 minut.
AAT – aspartate aminotransferase (= GOT – glutamate oxalacetate transaminase)
E.C. 2.6.1.1 – dimer – c, m, p – až 4
často variabilní; častý výskyt sekundárních proužků, které mohou komplikovat alelické vyhodnocení; poměrně citlivý na teplotu
| Roztok A: | |
|---|---|
| 0,1M Tris–HCl buffer, pH = 8.4 | 20 ml |
| aspartic acid 240 mg | |
| α-ketoglutaric acid 40 mg | |
| Roztok B: | |
| 0,1M Tris–HCl buffer, pH = 8.4 | 20 ml |
| pyrodoxal-5-phosphate 25 mg | |
| Fast Blue BB salt 50 mg | |
| Fast Violet B salt 50 mg | |
Roztok A připravovat na světle dostatečně dlouho (min. 15 minut) předem, při rozpouštění nutno zahřát na cca 50°C, poté nechat zchladnout na pokojovou teplotu. Roztoky A a B smícháme těsně před inkubací ve tmě (!) a ihned nalijeme na gel. Inkubace ve tmě při 32°C. Po inkubaci slijeme barvicí směs, krátce gel opláchneme destilovanou dobou a fixujeme fixačním roztokem. Dobu fixace je nutno vyzkoušet, u některého materiálu možno přes noc, někdy ale začínají proužky po určité době (někdy jen 15 min.) slábnout, v té chvíli je nutno fixaci ukončit. Po skončení fixace slijeme fixační roztok (obsahuje methanol – nebezpečný odpad!) a gel oplachujeme v destilované vodě, kterou průběžně měníme (dokud je z gelu zřetelně cítit kys. octová).
DIA – diaphorase
E.C. 1.6.-.- – monomer, dimer, tetramer – c, m – 1 až 4
barví se většinou poměrně rychle, pozor na přebarvení; obvykle alespoň jeden dobře čitelný monomerní lokus + nějaké další, čtení ale někdy komplikováno sekundárními pruhy
| 0,1M Tris–HCl buffer, pH = 8.0 | 50 ml |
|---|---|
| NADH (reduced) 13 mg | |
| MTT 5 mg | |
| 2,6 dichlorindophenol 2 mg (sodium salt hydrate) |
Barvení při 37°C ve tmě
ENP – endopeptidase
E.C. 3.4.23.6 – monomer – ? – ?
| 0,1M Tris–maleic acid buffer, pH = 5.5 | 50 ml (+ asi 50 ml na oplachování) |
|---|---|
| BANA 5 mg (β-N-benzoyl-DL-arginine-α-naphthylamide.HCl) | |
| Fast Black K salt 5 mg | |
| MgCl2.6H2O 25 mg |
Alternativní postup (koncentrovanější roztoky, někdy se vyplatí při slabé aktivitě enzymu):
| Roztok A: | |
|---|---|
| 0,2M Tris–maleic acid buffer, pH = 5.5 | 50 ml (+ asi 50 ml na oplachování) |
| Fast Black K salt 20 mg | |
| MgCl2.6H2O 50 mg | |
| Roztok B: | |
| N,N-dimethylformamide 2 ml | |
| BANA 25 mg | |
Přilít roztok A do roztoku B, dobře promíchat (ve tmě).
Po skončení elektroforézy neoplachujeme kvůli pH v destilované vodě, ale v předem vychlazeném pufru (je proto třeba proto připravit asi 100 ml pufru). Barvení při 37°C ve tmě.
EST – esterases
E.C. 3.1.1. – monomer, dimer – c – 2 až 10
poměrně nespecifické barvení, vždy více lokusů; dosti variabilní, vhodný např. pro identifikaci klonů, ale alelická interpretace většinou obtížná (prolínání lokusů, apod.); poměrně citlivý na teplotu
| Esterase buffer, pH = 6.45 | 60 ml (+ asi 50 ml na oplachování) |
|---|---|
| 1-naphthyl acetate 25 mg (předem rozpustit v 2,5 ml 50% acetonu) | |
| 2-naphthyl phosphate 25 mg (předem rozpustit v 2,5 ml 50% acetonu) | |
| Fast Blue BB Salt 50 mg |
Gel po skončení elektroforézy neoplachujeme v dest. vodě, ale v esterasovém pufru (kvůli pH), je tedy potřeba připravit min. 100 ml pufru. Inkubace ve tmě při 32°C.
G6PDH (= G6PD) – glucose-6-phosphate dehydrogenase
E.C. 1.1.1.49 – dimer – c, p – 2
někdy poměrně rychlé barvení, proto pozor na přebarvení
| 0,05M Tris–HCl buffer, pH = 8,0 | 50 ml |
|---|---|
| glucose-6-phosphate 50 mg (disodium salt) | |
| MgCl2.6H2O 50 mg | |
| MTT 10 mg (možno nahradit NBT) | |
| NADP+ 6 mg | |
| PMS 2 mg |
Inkubace ve tmě při 32°C.
GLU – ß-D-glucosidase (= ß-D-glucoside glucohydrolase)
E.C. 3.2.1.21 – dimer – c – 1
0,05M potassium phosphate buff.,pH=6,5 50 ml (+ asi 50 ml na oplachování)
| 6-bromo-2-naphthyl-ß-D-glucoside | 50 mg (rozpustit v 5 ml N,N’-dimethylformamidu) |
|---|---|
| PVP-40 1 g | |
| Fast Blue BB salt 50 mg |
Po skončení elektroforézy neoplachujeme kvůli pH v destilované vodě, ale v předem vychlazeném pufru (je proto třeba proto připravit asi 100 ml pufru). Inkubace ve tmě při 32°C 60 minut a potom v pokojové teplotě přes noc (ve tmě!)
GDH – glutamate dehydrogenase
E.C. 1.4.1.2 – hexamer, monomer (?) – c – 1
| 0,05M Tris–HCl buffer, pH=8,0 | 50 ml |
|---|---|
| Na-glutamate 200 mg | |
| CaCl2 50 mg (anhydrous) | |
| NAD+ 10 mg | |
| MTT 10 mg | |
| PMS 2 mg |
Inkubace ve tmě při 32°C.
HEX – hexokinase (= glucokinase)
E.C. 2.7.1.1 – monomer – c, m, p – 2 až 3
| 0,1M Tris–HCl buffer, pH=7,1 | 50 ml |
|---|---|
| glucose 45 mg | |
| MgCl2.6H2O 50 mg | |
| ATP 12,5 mg (disodium salt) | |
| NADP+ 12,5 mg | |
| NBT 10 mg | |
| PMS 1,5 mg | |
| glucose-6-phosphate dehydrogenase 40 µl (= 40 U, zásobní roztok 1 U / µl) |
Dehydrogenasu přidáváme až jako poslední těsně do již hotového roztoku před aplikací na gel, promícháme. Inkubace ve tmě při 37°C. Existují i alternativní barvení (vyšší pH, náhrada některých složek).
IDH – isocitrate dehydrogenase
E.C. 1.1.1.42 – dimer – c – 1
| 0,1M Tris–HCl buffer, pH=8,0 | 50 ml |
|---|---|
| isocitric acid 50 mg (trisodium salt) | |
| MgCl2.6H2O 80 mg | |
| NADP+ 10 mg | |
| MTT 8 mg | |
| NBT 8 mg | |
| PMS 2 mg |
Inkubace ve tmě při 32°C.
LAP – leucine aminopeptidase (= AMP – aminopeptidase)
E.C. 3.4.11.- – monomer – c – 2 až 3
obvykle dosti variabilní; velmi citlivý na teplotu a kvalitu vzorku
| Roztok A: | |
|---|---|
| 0,2M Tris–maleate buffer, pH = 6.0 | 30 ml (+ asi 50 ml na oplachování) |
| MgCl2.6H2O 60 mg | |
| L-leucyl-β-naphthylamide hydrochloride35 mg (rozpustit v 2,5 ml 50% acetonu, ve tmě) | |
| Roztok B: | |
| 0,2M Tris–maleate buffer, pH = 6.0 | 30 ml |
| Fast Black K salt 25 mg | |
Gel po skončení elektroforézy neoplachujeme v dest. vodě, ale v pufru (kvůli pH), je tedy potřeba připravit min. 100 ml pufru. Gel inkubujeme při 32°C nejprve pouze v roztoku A, po 10 min. přidáme roztok B.
MDH – malate dehydrogenase
E.C. 1.1.1.37 – dimer – c, m – 3
| Roztok A: | |
|---|---|
| 0,1M Tris–HCl buffer, pH=7,5 | 20 ml |
| malic acid 150 mg (po rozpuštění upravit pH pomocí Na2CO3 na 7,5) | |
| Roztok B: | |
| 0,1M Tris–HCl buffer, pH=7,5 | 30 ml |
| NAD+ 15 mg | |
| NBT 15 mg (možno nahradit 10 mg MTT) | |
| PMS 2 mg | |
Smísíme roztoky a aplikujeme na gel, inkubujeme ve tmě při 32°C.
ME – malic enzyme
E.C. 1.1.1.40 – tetramer – c – 1
| 0,05M Tris–HCl buffer, pH=8,0 | 50 ml |
|---|---|
| malic acid 150 mg | |
| MgCl2.6H2O 50 mg | |
| NADP+ 5 mg | |
| MTT 10 mg | |
| PMS 2 mg |
Inkubace ve tmě při 32°C.
NADHDH (= NDH) – NADH dehydrogenase
E.C. 1.6.99.- – monomer, dimer, tetramer (?) – c, m, p – 1-4 (?)
většinou je tento název používán i pro DIA, resp. nejsou oba enzymové systémy odlišovány (katalyzují téměř totéž, někdy se oběma barveními barví stejné enzymy, ale někdy ne)
| 0,1M Tris–HCl buffer, pH=8,4 | 30 ml |
|---|---|
| menadion 15 mg (rozpustit v 2,5 ml 50% acetonu) | |
| NADH (reduced) 17,5 mg | |
| MTT 20 mg |
Inkubace ve tmě při 37°C.
PRX – peroxidase
E.C. 1.11.1.7 – monomer – c – 2-13
| 0,05M sodium acetate buffer, pH=5,0 | 50 ml (+ asi 50 ml na oplachování) |
|---|---|
| CaCl2 11 mg (anhydrous) | |
| 3% H2O2 250 µl | |
| 3-amino-9-ethyl carbazole 25 mg (rozpustit v 5 ml N,N’-dimethylformamidu) |
Gel po skončení elektroforézy neoplachujeme v dest. vodě, ale v pufru (kvůli pH), je tedy potřeba připravit min. 100 ml pufru. Inkubace v lednici. Po vyvinutí proužků fixace ve fixačním roztoku.
PGI – phosphoglucoisomerase (= GPI – glucosephosphate isomerase, phosphohexose isomerase)
E.C. 5.1.3.9 – dimer – c, p – 2
někdy se spolu s PGI barví další enzymy (které následují v kaskádě za ním, 6PGDH nebo G6PDH), ale interpretace je možná, pokud se lokusy nepřekrývají
| 0,05M Tris–HCl buffer, pH=8,0 | 50 ml |
|---|---|
| fructose-6-phosphate 20 mg | |
| MgCl2.6H2O 24 mg | |
| NADP+ 10 mg | |
| MTT 10 mg | |
| PMS 2 mg | |
| glucose-6-phosphate dehydrogenase 7 µl (= 7 U, zásobní roztok 1 U / µl) |
Dehydrogenasu přidáváme až jako poslední těsně do již hotového roztoku před aplikací na gel, promícháme. Inkubace ve tmě při 32°C.
PGM – phosphoglucomutase
E.C. 2.7.5.1 – monomer – c, p – 2
někdy se spolu s PGM barví další enzymy (které následují v kaskádě za ním, 6PGDH nebo G6PDH), ale interpretace je možná, pokud se lokusy nepřekrývají
| 0,05M Tris–HCl buffer, pH=8,5 | 50 ml |
|---|---|
| glucose-1-phosphate 50 mg | |
| MgCl2.6H2O 24 mg | |
| NADP+ 10 mg | |
| MTT 10 mg | |
| PMS 2 mg | |
| glucose-6-phosphate dehydrogenase 7 µl (= 7 U, zásobní roztok 1 U / µl) |
Dehydrogenasu přidáváme až jako poslední těsně do již hotového roztoku před aplikací na gel, promícháme. Inkubace ve tmě při 32°C.
6-PGDH (= 6-PGD, PGD) – 6-phosphogluconate dehydrogenase
E.C. 1.1.1.44 – dimer – c, p – 2
obvykle se barví rychle (pozor na přebarvení); málo citlivý na teplotu; někdy se zároveň negativně barví SOD
| 0,1M Tris–HCl buffer, pH=8,4 | 30 ml |
|---|---|
| 6-phosphogluconic acid 10 mg | |
| MgCl2.6H2O 30 mg | |
| NADP+ 5 mg | |
| MTT 5 mg | |
| PMS 1 mg |
Inkubace ve tmě při 32°C.
SKDH (= SKD) – shikimate dehydrogenase
E.C. 1.1.1.25 – monomer – c, p – 1,2
obvykle se barví rychle (pozor na přebarvení); málo citlivý na teplotu; někdy se zároveň negativně barví SOD
| 0,1M Tris–HCl buffer, pH=8,4 | 30 ml |
|---|---|
| shikimic acid 30 mg | |
| NADP+ 5 mg | |
| MTT 6 mg | |
| PMS 1 mg |
Inkubace ve tmě při 32°C.
SOD – superoxide dismutase (= TO – tetrazolium oxidase)
E.C. 1.15.1.1 – dimer, tetramer – c, p – 3
negativní barvení; málo citlivý na teplotu
| 0,05M Tris–HCl buffer, pH=8,2 | 50 ml |
|---|---|
| NBT 5 mg | |
| EDTA 4,5 mg | |
| riboflavine 1,5 mg |
Inkubace ve tmě při 37°C po dobu 20 min a potom na světle (ideálně pod lampou) za laboratorní teploty až do objevení světlých proužků na tmavém pozadí. Nenechávat na světle zbytečně dlouho, časem (cca 20 min., třeba vyzkoušet) proužky začínají slábnout (pozadí se barví i do nich).
Na začátek >>
