Laboratoř molekulární biologie rostlin PřF JU

Elektroforéza a barvení

Pro isozymovou analýzu se používají buď horizontální škrobové nebo vertikální polyakrylamidové gely. V naší laboratoři používáme kvůli lepšímu rozlišování i delšímu uchovávání polyakrylamidové gely.

Pozor! Akrylamid je před zpolymerováním velmi jedovatý (neurotoxin), a to jak při styku s kůží, tak při vdechnutí (např. při vážení). Při manipulaci s ním a s jakýmikoliv předměty, které s ním přišly do styku (skla, stojánek, apod.) dbáme zvýšené opatrnosti a pracujeme zásadně v rukavicích a plášti, při vážení navíc s respirační rouškou. Veškeré kontaminované předměty co nejdříve oplachujeme větším množstvím vody. Odpadní roztoky obsahující akrylamid (např. nezpolymerovaný zbytek roztoku pro přípravu gelu) musí být skladovány ve zvláštní láhvi a zlikvidovány jako nebezpečný odpad, nikdy je proto nevyléváme do běžného odpadu. Polyakrylamid je již netoxický, ale protože polymerace nikdy neproběhne dokonale a na gelech i aparatuře mohou být zbytky nezpolymerovaného akrylamidu, pracujeme i s hotovými gely zásadně v plášti a v rukavicích.

Pozor! Enzymy jsou velmi citlivé na teplo, proto je nutné elektroforézu důkladně chladit. Vzhledem k provizornímu chlazení v naší laboratoři (i vzhledem k délce elektroforézy) je dobré připravit gely a aparaturu (kroky a–c) odpoledne a nechat přes noc vychladit v lednici a elektroforézu a barvení provádět další den.

a) Sestavení skel (do tzv. sendvičů)

Pozor! Skla pro elektroforézu jsou velmi křehká a zároveň drahá, proto s nimi zacházíme velmi opatrně. Je nutné, aby nebyly poškozené hrany a rohy, aparatura by pak netěsnila.

• Aparatura v laboratoři (Hoefer 600SE) umožňuje používat najednou 1, 2 nebo 4 gely.
• Do nalévacího stojánku umístíme těsnící vložky (silikonovou „gumovou“ stranou nahoru), stojánek postavíme na vodorovný stůl. Stojánek umístíme do misky, která by zachytila vytékající akrylamid v případě, že by skla byla špatně sestavená a netěsnila.
• Skla zkontrolujeme, pokud jsou znečištěná, omyjeme destilovanou vodou a vysušíme nebo necháme oschnout. Před sestavením vždy otřeme lihem (stačí denaturovaný), necháme uschnout. Čistá skla bereme pouze za hrany a nepokládáme je přímo na stůl (lze na podložku z buničiny nebo filtrační papír).
• Spacery a hřebeny omyjeme lihem, necháme uschnout.
• Na kratší strany vnějšího skla (bez výřezu)položíme pár spacerů, na ně položíme vnitřní sklo (divider plate, tenčí sklo s výřezem), na něj opět pár spacerů a na ně druhé vnější sklo. (Tento postup platí pro přípravu čtyř gelů najednou. Při dvou gelech se vynechává krok s vnitřním sklem a druhou sadou spacerů; při použití jediného gelu se druhý sendvič nahrazuje speciální skleněnou deskou.)
• Z boku nasadíme na připravený sendvič upínací nástavce s povolenými šrouby a krajní šrouby lehce dotáhneme.
• Zvedneme sendvič do vertikální polohy, postavíme spodní stranou na stůl, povolíme šrouby a srovnáme skla a spacery. Spacery musí být dotlačené úplně do boku na kraj skel a nesmí přesahovat nahoru nad skla. Lehce přitáhneme krajní šrouby, skla otočíme o 180° a postup opakujeme s horní hranou. Opakujeme tak dlouho, než jsou spacery zcela na kraji a spodní a horní hrany skel a spacerů zcela v rovině. Pozor! Důkladně zkontrolujeme, jakákoliv nerovnost by mohla vést k netěsnosti aparatury a vytékání akrylamidu nebo elektrodového pufru.
• Přiměřeně (ne velkou silou) dotáhneme všechny boční šrouby; postupujeme po obou hranách zároveň, nikdy křížem (skla by mohla prasknout).
• Spodní hranu skel namažeme vazelínou (při rutinním zvládnutí postupu lze vynechat) a skla postavíme do stojánku.
• Z boku do otvorů na stojánku vložíme utahovací kolíky, delším koncem dolů.
• Plynulým pohybem utáhneme kolíky (oba najednou a stejným směrem) plynulým pohybem směrem nahoru o 180°, skla se mírně „zaboří“ do podložky.

b) Příprava gelů

• Pro analýzu isozymů se používáme diskontinuální gely složené ze spodního 8,16% separačního gelu a 4% zaostřovacího (koncentračního gelu).
• Připravíme si 10% roztok APS (ammonium persulfate), který nelze dlouhodobě skladovat a je třeba připravit vždy čerstvý. Do 1,5 ml eppendorfky navážíme na analytických vahách množství podle počtu gelů a rozpustíme v destilované vodě.

• Na vnější sklo uděláme fixem značku 3,5 cm od horního okraje.
• Do vysoké 250 ml kádinky připravíme následující směs podle množství gelů:

• Opatrně mícháme kroužením (netřepat a nedělat bubliny, kyslík brzdí polymeraci) tak dlouho, dokud roztok nebude homogenní (nebudou v něm viditelná „vlákna“ akrylamidu).
• Přidáme poslední dvě látky, které spouští a katalyzují polymeraci:

• Opatrně promícháme a ihned naléváme gel
• Nabereme roztok do stříkačky, přiložíme na okraj skel a spustíme jednu větší kapku po spaceru, až dosáhne dna skel, plynulým proudem naléváme roztok až po značku. Při nalévání kontrolujeme, jestli nevznikají při hladině bubliny (pokud ano, vyženeme je na hladinu a necháme prasknout).
• Po nalití všech gelů ihned převrstvíme roztok akrylamidu destilovanou vodou. Nabereme vodu do 5 ml špičky a pomalu vypouštíme po jednom spaceru. Voda se nemísí s roztokem akryalmidu a vytváří klín na hladině, přestaneme přidávat, až špička klínu dosáhne asi 1 cm od druhého spaceru.
• Necháme gel nejméně 1 hodinu polymerovat. Stejně tak necháme polymerovat zbytek roztoku v kádince, nevyléváme ho do odpadu!
• Po zpolymerování separačního odsajeme injekční stříkačkou vodu nad gelem. Protože obsahuje i zbytky nezpolymerovaného akrylamidu, zacházíme s ní jako s nebezpečným odpadem! Stejně zacházíme s nezpolymerovaným zbytkem v kádince!
• Do vysoké 100 ml kádinky připravíme následující směs pro koncentrační gel:

• Opatrně mícháme kroužením (netřepat a nedělat bubliny, kyslík brzdí polymeraci) tak dlouho, dokud roztok nebude homogenní (nebudou v něm viditelná „vlákna“ akrylamidu).
• Přidáme poslední dvě látky, které katalyzují polymeraci:

• Opatrně promícháme a ihned naléváme gel
• Nabereme roztok do stříkačky a naléváme do úrovně výřezů ve vnitřním skle (resp. asi 5 mm pod okraj skel při nalévání jediného gelu v sendviči)
• Mezi skla zastrčíme hřebeny. Při použití čtyř gelů je dobré srovnat hřebeny tak, aby jamky v rámci jednoho sendviče byly přesně za sebou (usnadní to nanášení vzorků).
• Zkontrolujeme, jestli nezůstaly bubliny pod zuby hřebenů, pokud ano, vyženeme je pohybem nebo nadzvednutím hřebene.
• Necháme gel nejméně 1 hodinu polymerovat. Stejně tak necháme polymerovat zbytek roztoku v kádince, nevyléváme ho do odpadu!
• Během polymerace si připravíme elektrodový pufr (viz protokoly „Roztoky a pufry“).
• Po zpolymerování gelu opatrně vyjmeme hřebínky (pozor na poškození jamek!). Případné zbytky roztoku co nejrychleji odsajeme injekční stříkačkou. Roztok obsahuje zbytky nezpolymerovaného akrylamidu, zacházíme s ním jako s nebezpečným odpadem!
• Jamky ihned naplníme elektrodovým pufrem (pipetou, vypouštíme prudce, jamky se proudem pufru lépe vypláchnou).
• Znovu vysajeme pufr z jamek (nyní již s ním zacházíme jako s běžným odpadem) a jamky znovu naplníme elektrodovým pufrem.
• Horní hranu gelů překryjeme alobalem, aby nevysychaly, a dáme chladit do lednice.

c) Příprava aparatury

• Spodní vanu pro elektroforézu naplníme ředěným elektrodovým tris-glycinovým pufrem (2,4 l neředěného pufru + 1,8 l destilované vody). Do vany vložíme magnetické míchadlo.
• Vanu elektroforézy umístíme do větší plastové vany a vložíme do lednice pro elektroforézu. Do vany zasuneme skleněný výměník tepla. Necháme vychladit přes noc.
• Do výřezů na spodní straně horní vany elektroforézy vložíme těsnící vložky. Výřezy nejprve postříkáme malým množstvím destilované vody, kapky rozetřeme do plochy a na ně těsnění „přilepíme“. Umístíme do lednice a necháme vychladit přes noc.

d) Nanášení vzorků a elektroforéza

• Zapneme chlazení (spínač na boku pro chlazení + zapojení pumpičky prostým zapojením druhého kabelu do elektrické sítě) a zapneme magnetické míchadlo.
• Aparaturu elektroforézy v lednici obsypeme ledem.
• Dáme rozmrazit vzorky (trvá asi 15–20 minut), po rozmrznutí uchováváme na ledu!
• Těsně před nanášením vzorků vyndáme z lednice stojánek s gely, doplníme do jamek vychlazený elektrodový pufr až po okraj.
• Pipetou nanášíme 30 µl vzorku (v případě potřeby je množství možné upravit). Pozor! Pracujeme co nejrychleji, aby se vzorky citlivé na teplo co nejméně zahřívaly.
• Po nanesení vzorků povolíme šrouby držící gely ve stojánku (plynulým pohybem k sobě oba šrouby najednou o 180°; delší konec bude nakonec mířit dolů) a vyjmeme je z otvorů.
• Na horní hranu skel nasadíme horní vanu elektroforézy, do otvorů vložíme šrouby delším koncem nahoru a přitáhneme plynulým pohybem o 180° k sobě (delší konce dolů).
• Horní vanu s gely vložíme do spodní vany tak, aby výměník tepla zůstal mezi gely.
• Nalijeme elektrodový pufr (neředěný tris-glycinový pufr) do horní vany. Pufr naléváme nejprve do středu vany a pomalu zaplavujeme štěrbiny spojující vanu s gely, nikdy nenaléváme pufr přímo do štěrbin, aby se nevyplavily vzorky z jamek. Pufr naléváme do výšky asi 0,5 – 1 cm (ne více!) nad drátek (elektrodu) vprostřed vany.
• Vanu přikryjeme víkem, otvory ve víku musí dosednout přesně na konce elektrod.
• Připojíme elektroforézu na zdroj elektrického proudu, dbáme na správnou polaritu.
• Zapneme elektroforézu na konstantní proud 80 mA, po ustálení (cca po 1 min.) zaznamenáme do protokolu hodnotu proudu, napětí a výkonu.
• Pravidelně kontrolujeme průběh elektroforézy. Ve chvíli, kdy zbarvené čelo elektroforézy dosáhne asi 0,5 cm od spodního okraje (asi 4:30–5 hod.), vypneme zdroj elektřiny a odpojíme elektroforézu od zdroje.
• Do protokolu zaznamenáme celkovou dobu elektroforézy a koncové hodnoty proudu, napětí a výkonu.

e) Příprava barvení

V průběhu elektroforézy připravíme barvicí roztoky. Pozor! Barvící roztoky jsou citlivé na světlo. Všechny látky vystavujeme světlu co nejméně, ihned po vážení je uklízíme zpět do skříně nebo lednice, navážená množství uchováváme v kádince obalené alobalem, ihned po vážení je odneseme do temné komory.

• V průběhu elektroforézy připravíme barvicí roztoky.
• Na analytických vahách navážíme látky do barvícího roztoku podle receptů pro jednotlivé enzymové systémy. Pracujeme vždy v rukavicích, některé z používaných látek jsou jedovaté. Navážené látky přesypeme do 100 ml kádinek obalených alobalem.
• Pokud je součástí postupu přidání enzymu do barvicího roztoku, nepřidáváme jej nikdy během vážení, ale až těsně před aplikací roztoku na gel.
• Navážené směsi skladujeme v temné komoře.
• Odměříme si příslušné objemy pufrů. Používáme připravené zásobní roztoky dané koncentrace, kde je potřeba, upravíme pH.
• Asi 10 minut před koncem elektroforézy rozpustíme navážená barviva v příslušných pufrech (někdy rozpouštění několik minut trvá, je třeba barviva důkladně rozmíchat).
• Těsně před skončením elektroforézy připravíme barvicí misky, do kterých dáme vychlazenou destilovanou vodu nebo vychlazený pufr pro opláchnutí gelů (podle enzymového systému).

f) Vyjmutí gelů

• Vytáhneme gely z aparatury, pufr z horní vany vylijeme do spodní vany nebo do odpadu.
• Gely umístíme do stojánku, povolíme šrouby a odstraníme horní vanu.
• Sendvič položíme na stůl, povolíme šrouby na upínacích nástavcích a ty odděláme, skla opatrně položíme na filtrační papír na stůl.
• Plastovou špachtlí (tenčím koncem) nebo nožem zatlačíme na spodní stranu spacerů a vytáhneme je. Snažíme se nepoškodit gel se vzorky.
• Širší konec plastové špachtle přiložíme asi do poloviny boční strany skel do mezery po spaceru (případně přiložíme nůž po celé délce skel), druhou stranu skla přidržujeme prsty a opatrně zapáčíme, dokud se skla neodlepí od sebe. Pokud gel zůstane přilepený na horním skle, rychle sklo otočíme gelem nahoru a položíme na stůl.
• Odřízneme koncentrační gel a šikmým ukrojením pravého spodního rohu označíme pozici posledního vzorku (pozor na opačnou orientaci gelu, pokud zůstal na horním skle!).
• Navlhčíme si rukavice, nadzvedneme jeden okraj gelu, uchopíme do prstů a plynulým pohybem zvedneme ze skla a přeneseme do připravené barvicí misky.

g) Barvení

• Gely v barvicích miskách necháme chvíli oplachovat.
• Slijeme destilovanou vodu nebo oplachovací pufr, gely v miskách přeneseme do temné komory a (za minimálního osvětlení) nalijeme do misek barvicí roztok. Pokud je součástí postupu přidání enzymu, přidáme jej těsně před nalitím roztoku na gel.
• Promícháme a vložíme do termostatu.
• Průběžně promícháváme barvící roztok a kontrolujeme (za minimálního osvětlení!) stav barvení, abychom gely nepřebarvili.
• Po skončení barvení slijeme barvicí roztok do k tomu určené nádoby (jde o nebezpečný odpad, nelze vylévat do běžného odpadu!). Gel opláchneme v destilované vodě.
• Pokud je to potřeba (jen některé enzymové systémy), fixujeme gel ve fixačním roztoku. Po skončení fixace vylijeme fixační roztok do nádoby na nebezpečný odpad, nevyléváme jej nikdy do běžného odpadu!
• Gel oplachujeme v destilované vodě, kterou průběžně měníme, dokud se z gelu nevymyjí zbytky barvícího (příp. fixačního) roztoku.

Vysušení gelu

Akryalmidové gely lze vysušit mezi dvěma vrstvami celofánu a ± trvale uchovávat ve vysušeném stavu:

• Do fotografické misky nalijeme 1–2 cm destilované vody (podle použitých rámečků).
• Na dno misky vložíme rámeček.
• Vezmeme list celofánu a oplachujeme pod mírně tekoucí vodou, dokud nezměkne.
• Rozprostřeme list celofánu na rámeček tak, aby pod ním ani nad ním nezbyly žádné bubliny (případné bubliny vyženeme na hladinu a necháme prasknout).
• Na celofán položíme gel.
• Opláchneme druhý list celofánu a opatrně přiložíme na spodní celofán a gel. Mezi oběma vrstvami celofánu ani okolo gelu nesmí zbýt žádné bubliny (potrhaly by vysýchající gel).
• Přiložíme horní rámeček.
• Srovnáme gel a obě vrstvy celofánu tak, aby vyčnívaly z rámečků na všechny strany stejně daleko a posuneme gel do středu rámečku.
• Ohneme obě vrstvy celofánu přes jednu delší stranu rámečku, vyženeme bubliny (nesmí se dostat mezi rámečky ke gelu) a přichytíme celofán k rámečkům kolíčky na prádlo. Napneme celofán a pokračujeme s dalšími dvěma stranami.
• Narovnáme gel do středu rámečků, podepřeme jej prsty (aby se nesesunul) a zvedneme rámečky tak, aby poslední volná strana zůstala dole. Vypustíme přebytečnou vodu. Vrátíme rámečky zpět do misky a přichytíme kolíčky i poslední stranu.
• K rámečkům připneme popisek (enzymový systém, datum zpracování) a necháme gel vyschnout. Při použití tenkých rámečků je ještě musíme po asi 30 min. až 1 hodině přepnout na pevnou podložku, aby se vysýchající celofán nezkroutil.
• Po cca 2 dnech můžeme vysušený gel vyjmout z rámečků. Ostřihneme celofán tak, aby zbyl okolo gelu asi 1 cm široký pruh, na který napíšeme čísla vzorků a studovaný druh, datum a enzymový systém.
• Gel necháme několik dnů lisovat. Gely dále uchováváme v suchu a zbytečně nevystavujeme světlu (pokud s gelem zrovna nepracujeme, uchováváme jej v neprůhledných deskách ve skříni nebo šuplíku, ve tmě).