Laboratoř molekulární biologie rostlin PřF JU

Polymerázová řetězová reakce
PCR (Polymerase Chain Reaction)

Princip

Polymerázová řetězová reakce byla objevena v roce 1983 Kary Mullisem (Nobelova cena za chemii). Jde o jednoduchou metodu zmnožení (amplifikace) určité části DNA in vitro.

Základní uspořádání PCR vyžaduje vytvoření směsi reagencií a následné cyklické střídání teplot této směsi.

Složky PCR (PCR mix)

• templátová DNA – naše studovaná DNA nebo její část, kterou chceme namnožit (gen, část genu nebo nekódující sekvence)
• DNA polymeráza – enzym, který buduje nový řetězec DNA podle vzoru templátu
• PCR pufr – udržuje stabilní pH a obsahuje chemikálie pro optimální aktivitu a stabilitu DNA polymerázy
• MgCl2 – Mg²⁺ ionty slouží jako kofaktor DNA polymerázy
• nukleotidy (dNTP) – směs deoxynukleosid trifosfátů (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), základních stavebních jednotek DNA
• primery – oligonukleotidy (krátké úseky jednořetězcové DNA), zpravidla o délce 10–25 bazí párující se s komplementární sekvencí v templátové DNA a sloužící jako počáteční místo replikace DNA, bez kterého by DNA polymeráza nemohla začít syntézu nového řetězce; k extenzi primeru dochází ve směru 5'→3' nově vznikajícího vlákna.

PCR teplotní program

Cyklické střídání teplot umožňuje přístroj zvaný termocykler.

• Na počátek cyklu se zařazuje počáteční denaturace (94–98°C, 1-10 min); následuje
• vlastní cyklus:
• denaturace (94-98 °C, 20 s–1 min): dvoušroubovice DNA se rozplétá na dva řetězce Pozn.: Pro GC bohaté DNA templáty může být denaturace prodloužena na 3-4 min.
• nasednutí primerů (annealing) (45-60°C, cca 20-45 s): primery se specificky párují s komplementární oblastí na templátové DNA Teplota nasedání primerů by měla být o 5°C nižší než teplota tání (denaturace), tzv. melting temperature (Tm) primerů. Pro primery kratší než 25 bp se Tm vypočítá podle rovnice: Tm = 4(G+C) + 2(A+T)
• syntéza DNA (elongace, extenze) (většinou 72 °C, 1 min) – optimální teplota pro činnost DNA polymerázy; na tvorbu 1 000 bazí je potřeba 1 min
• Finálním krokem je :
• konečná elongace (72°C, 5-15 min): dokončení syntézy částečných produktů
• zchlazení PCR reakce (4-15°C)

Střídáním tří teplot dochází k exponenciálnímu množení požadovaného úseku DNA vymezeného dvojicí použitých primerů. Počet cyklů u běžné PCR se pohybuje od 25 do 40. Výsledkem PCR je pak 225-240 kopií příslušného úseku DNA z každé molekuly templátové DNA. DNA lze vizualizovat po inkorporaci UV fluorescenčního barviva (např. Syber Green, ethidiumbromid ) do dvoušroubovice DNA pod UV světlem.

Optimalizace PCR

Cílem optimalizace je specifický průběh PCR reakce, tj. aby vznikal pouze jediný produkt odpovídající amplifikovanému úseku. Výsledek PCR reakce proto ověřujeme na gelu. V případě, že produkt PCR reakce není zřetelný nebo je výsledkem více produktů odlišné délky (nespecifické produkty), reakce neproběhla optimálně. Je nutné změnit reakční podmínky tak, aby PCR proběhla úspěšně. Je několik možností:

• změna koncentrace DNA – snížením koncentrace DNA snížíme i koncentraci případných inhibitorů PCR, které mohou být přítomny ve vzorku, PCR může úspěšně proběhnout i s množstvím DNA menším než 1 ng; někdy naopak pomůže zvýšit koncentraci DNA až na 50 ng
• změna teploty nasednutí primeru (annealingu) – snížením umožníme lepší vazbu primerů na templátovou DNA, přílišné snížení však může vést k tvorbě nespecifických produktů. Ideální je provést gradientový pokus a následně vybrat nejvhodnější teplotu.
• zvýšení koncentrace MgCl2 – hořčík stabilizuje komplex DNA–polymeráza, zvýšení koncentrace na 2.5 – 6.0 mM (standardní koncentrace je 1.5-2.0 mM) může přinést úspěch
• přidání aditiv – některé látky (DMSO, formamid, betaine, glycerol, BSA, (NH4)2SO4) mohou zvyšovat stabilitu polymerázy, specifičnost vazby primerů
• modifikace cyklu – prodloužení (zkrácení) doby elongace, zvýšení počtu cyklů, apod.
• touch-down protokol – do teplotního programu se na počátek amplifikace zařadí 3–5 cyklů s vyšší teplotou nasedání primerů. V prvních cyklech vzniká určité minimum jen specifických produktů, tím se redukuje nespecifické nasedání primeru a snižuje se tvorba nespecifických produktů. V dalších cyklech se použije nižší teplota, která zajistí dostatečný výtěžek.
• úprava tzv. ramping time (rychlosti přechodu z jedné teploty na druhou) – např. AFLP vyžaduje pomalé ohřívání vzorku (při rychlém zahřívání část primerů odpadne), pro dostatečný výtěžek je nutné snížit ramping time na 1°C/s (standardně bývá 3°C/s).

PCR protokol s využitím Plain PP Master Mixu (Top-Bio)

Plain PP Master Mix již obsahuje PCR pufr, hořčík, nukleotidy a DNA polymerázu. Jeho použitím se výrazně snižuje čas nutný pro přípravu PCR reakce. Snížením počtu pipetovacích kroků je eliminována chybovost při přípravě.
Postup

• Po celou dobu pracujeme na ledu. Všechny potřebné reagencie necháme rozmrznout. Mezitím si označíme PCR zkumavky nebo stripy.
• Do 1.5 ml eppendorfky připravíme PCR směs pro příslušný počet vzorků + 1 vzorek (rezerva pro pipetovací chybu). Např. máme 10 vzorků, PCR směs připravíme pro 11 vzorků.
• Jednotlivé složky pipetujeme v pořadí: voda, primery a Plain PP Master Mix. Promícháme na vortexu a krátce stočíme na stolní centrifuze.
• Příprava PCR směsi pro jeden vzorek:

Plain PP Master Mix ve finální koncentraci obsahuje 75mM Tris/HCl, pH 8,8; 20mM (NH4)2SO4; 0,01% Tween20; 2,5mM MgCl2; 200µM dATP, 200µM dCTP, 200µM dTTP, 200µM dGTP; 1,25 U Taq DNA polymerázy.