Extrakce vzorků
a) odběr vzorků v terénu
Isozymy izolujeme vždy z čerstvého živého materiálu. Ideální materiál je u každého druhu třeba vyzkoušet, protože aktivita jednotlivých enzymů se mezi jednotlivými orgány může lišit a může se dosti měnit během ontogenetického vývoje. Nejčastěji se používají mladé listy. Pro izolaci potřebujeme v typickém případě okolo 0,75 g tkáně, což obvykle odpovídá 1 až několika málo cm2 listu.
Je třeba dávat pozor, aby odebraná tkáň byla zdravá, bez parazitů (houby, hmyz), a v dobrém fyziologickém stavu (nezvadnutá, nepřemrzlá, apod.). Ihned po odběru ukládáme vzorky do vlhkého a chladného prostředí, dbáme na to, aby nezvadly, nevyschly a nepřehřívaly se. Různé druhy jsou na stav tkáně při odběru různě citlivé, u těch nejcitlivějších je třeba sbírat v optimálních podmínkách (např. ráno, dokud je chladno a vlhko, může vadit i mírné zavadnutí přes poledne).
Vzorky co nejrychleji dopravíme do laboratoře k dalšímu zpracování a celou dobu se je snažíme držet v chladnu. Typický postup při odběru v terénu je následující:
- List ihned po utržení zabalíme do vlhkého ubrousku nebo toaletního papíru
- Vzorek vložíme do igelitového pytlíku („zip-lock“) a ihned popíšeme
- Vložíme do termosky s ledem (lépe větší kusy než drobná tříšť)
- Transportujeme do laboratoře. Obvykle je možné v termosce uchovat vzorky v použitelném stavu maximálně 2–3 dny. V laboratoři před zpracování uchováváme vzorky v lednici
b) izolace v laboratoři
Vzorky izolujeme v pufru, který stabilizuje pH a obvykle obsahuje antioxidanty a další látky, které stabilizují proteiny a umožní uchovat enzymatickou aktivitu. Izolačních pufrů existuje celá řada, je třeba vždy vyzkoušet nejvhodnější pro zkoumaný materiál (předpisy pro 3 nejčastěji používané v naší laboratoři viz Roztoky a pufry). Někdy je dobré přidat ke vzorku malé množství látky Dowex-Cl, optimální množství je třeba vyzkoušet (obvykle snižuje intenzitu pozadí na gelech, ale může snižovat i aktivitu enzymů).
Celá procedura vyžaduje důkladné chlazení. Pracujeme na ledu. Před začátkem izolace dáme vychladit centrifugu na 4°C a vychladíme třecí misky a tloučky (delší dobu v lednici, při opakovaném použití během izolace alespoň krátce vychladíme v mrazáku při –20°C).
Postup izolace:
- Do vychlazené třecí misky v ledové tříšti vložíme 0,6–0,8 g rostlinné tkáně
- Přidáme 750 µl vychlazeného izolačního pufru (uchováváme v kádince v ledové tříšti) a případně Dowex-Cl.
- Tloučkem homogenizujeme rostlinný materiál. U tuhých listů může pomoct nastříhání na malé kousky nebo přidání trochy sterilního písku.
- Homogenát přepipetujeme do 1,5 ml eppendorfky. Obvykle je nutné ustřihnout asi 3 mm špičky, abychom získali širší otvor, úzký by se ucpával.
- Centrifugujeme v centrifuze vychlazené na 4°C 10 minut při 13800 rpm.
- Supernatant rozpipetujeme do 0,5 ml eppendorfek po 160 µl (dávka pro 5 vzorků + 10 µl rezerva), obvykle vychází dvě série přesně po 160 µl a třetí série s proměnlivým objemem.
- Vzorky buď hned dále zpracováváme nebo zamrazíme v –80°C (v tomto stavu lze uchovávat rok i déle; pro krátkodobé skladování lze použít i –20°C).
